Protein-Protein-Interaktionen

Möglichkeiten und Grenzen der Lichtmikroskopie

Wann und wo in lebenden Zellen Assoziationen von Proteinen oder anderen Molekülen stattfinden, ist eine Schlüsselfrage in der Erforschung ihrer Funktionen. Mit dem Paradigmenwechsel von der "Genomik" zur "Proteomik" gewinnt diese Frage zunehmend an Bedeutung.
Indem man Proteine mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen markiert, lässt sich ihre Lokalisation im Lichtmikroskop in lebenden Zellen verfolgen. Das Auflösungsvermögen eines Lichtmikroskops ist jedoch zu beschränkt, um einzelne Proteine oder gar deren Interaktion in einer Zelle zu beobachten. Einzelne Molekülkomplexe können zwar mit anderen Verfahren, wie beispielsweise der Elektronenmikroskopie dargestellt werden. Diese Verfahren erlauben es jedoch nur, fixierte und speziell vorbehandelte Präparate zu untersuchen. Eine Verlaufsbeobachtung an lebenden Zellen ist hiermit nicht möglich.

Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Messungen

Unter Ausnutzung eines physikalischen Phänomens, des Förster Resonanz Energie Transfers (FRET), läßt sich jedoch die relative Nähe von Molekülen über die optische Grenze der Lichtmikroskopie hinaus nachweisen. FRET tritt dann auf, wenn sich ein Donor-Fluorophor (D) in räumlicher Nachbarschaft (< 10 nm) zu einem geeigneten Akzeptormolekül (A) befindet. Der Donor kann dann einen Teil seiner Anregungsenergie auf das Akzeptormolekül übertragen. Der Akzeptor kann dann seinerseits einen Teil seiner Anregungsenergie in Form von Fluoreszenzlicht abgeben.

Wenn FRET auftritt, dann nimmt die Fluoreszenzintensität und die Fluoreszenzlebensdauer des Donors ab, während die Fluoreszenzintensität des Akzeptors zunimmt. Über die Messung einer oder mehrer dieser Parameter kann eine Bestimmung der FRET-Effizienz erfolgen.
Über die Bestimmung der Effizienz des Energieübertrages lassen sich zudem Informationen über den Abstand und die Orientierung von Donor und Akzeptormolekülen gewinnen. Mit Hilfe dieses Phänomens können nicht nur molekulare Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinpartnern untersucht werden, es ist auch mit Hilfe von geeigneten Markern möglich, Strukturänderungen innerhalb eines Moleküls zu untersuchen.

Abb. 1: Jablonski-Schema zum Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET). (Abb. aus: Biskup et al., Microsc. Res. Tech. 70, 442-451 (2007)).

Bestimmung der FRET Effizienz über Fluoreszenzlebensdauermessungen

Im Gegensatz zu Intensitäts-basierten FRET Messungen, die mittlerweile in der Fluoreszenzmikroskopie eine weite Verbreitung gefunden haben, ist es mit Fluoreszenzlebensdauer-basierten Messungen möglich, die Beiträge assoziierter und freier Donormoleküle zur Gesamtfluoreszenz verlässlich abzuschätzen.

Die Information über das Verhältnis interagierender und nicht-interagierender Donormoleküle kann durch eine Kurvenanpassung des Fluoreszenzabfalls bestimmt werden. Im einfachsten Fall lässt sich der Fluoreszenzabfall durch eine biexponentielle Funktion approximieren. Die langsame Lebensdauerkomponente (τs) entspricht dann der Lebensdauer der ungebundenen Donormoleküle, während die schnelle Lebensdauer (τf) eine Funktion des Abstandes und der Orientierung zwischen den interagierenden Donor- und Akzeptormolekülen ist. Die relative Amplitude (As, Af) entspricht den Beiträgen der gebundenen und ungebundenen Fraktion zum Gesamtfluoreszenzabfall.

Anwendungsbeispiele

Die Technik wurde in verschiedenen Studien angewandt, von denen einige in den folgenden Seiten vorgestellt werden:

Assoziation von Ionenkanälen mit ihren Untereinheiten
Struktur und Dynamik der postsynaptischen Membran
Intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden

Abb. 2: Interpretation multiexponentieller Fluoreszenzabklingkurven. Im Gegensatz zu Intensitäts-basierten Messungen der FRET-Effizienz ist es mit Hilfe von Fluoreszenzlebensdauermessungen möglich, zwischen interagierenden und nicht-interagierenden Subpopulationen zu unterscheiden. Das dargestellte Beispiel verdeutlicht dies. In dem Fall, dass alle Donor-Moleküle mit einem Akzeptor-Molekül assoziiert sind (links oben), beobachtet man (bei Wahl geeigneter Donorfluophore) nur einen monoexponentiellen Fluoreszenzabfall (blaue Kurve). Wenn nur ein Teil der Donormoleküle assoziiert ist (links unten), existieren hingegen zwei verschiedene Donormolekülpopulationen. Die Fluoreszenzlebensdauer der Moleküle, die an einen Akzeptor gebunden sind, ist durch FRET verkürzt, während die Fluoreszenzlebensdauer der ungebundenen Moleküle den Kontrollwerten entspricht. Entsprechend lässt sich ein biexponentieller Fluoreszenzabfall beobachten (grüne Kurve). Nur durch Fluoreszenzlebensdauermessungen lässt sich zwischen beiden Fällen unterscheiden. Bei Fluoreszenzintensitätsmessungen wird hingegen nur das Integral über die Kurve bestimmt.

Weiterentwicklung der Methodik

Trotz der beschriebenen Vorteile können jedoch Fluoreszenzlebensdauermessungen mit Fehlern behaftet sein. Die zum Markieren der Proteine verwandten Fluorophore können bleichen oder photokonvertieren. Die Fluoreszenzlebensdauer kann sich dabei verkürzen (Hoffmann et al., J. Biomed. Opt. 13, 031205 (2008)). Wenn keine zusätzlichen Kontrollen durchgeführt werden, könnte eine solche Verkürzung fälschlich als FRET interpretiert werden. Eine solche Kontrolle kann über spektral-aufgelöste Fluoreszenzlebensdauermessungen durchgeführt werden. Hierzu wird mit verschiedenen Techniken der Fluoreszenzabfall in mehreren spektralen Bereichen simultan gemessen. In unserer Arbeitsgruppe haben wir verschiedene Techniken zur spektral-aufgelösten Messung des Fluoreszenzabfalls in der Zeitdomäne etabliert.

Beteiligte Wissenschaftler

Ausgewählte projektbezogene Publikationen

Biskup C., Zimmer T., Benndorf K.,
FRET between cardiac Na+ channel subunits measured with a confocal microscope and a streak camera.
Nature Biotechnol. 22, 220-224 (2004).
Biskup C., Kelbauskas L., Zimmer T., Benndorf K., Bergmann A., Becker W., Ruppersberg J.P., Stockklausner C., Klöcker N.,
Interaction of PSD-95 with potassium channels visualized by fluorescence lifetime-based resonance energy transfer imaging.
J. Biomed. Opt. 9, 753-759 (2004).
Biskup C., Böhmer A., Pusch R., Kelbauskas L., Gorshokov A., Majoul I., Lindenau J., Benndorf K., Böhmer F.D.
Visualization of SHP-1 target interaction
J. Cell Sci. 177, 5165-5178 (2004).
Biskup, C., Zimmer, T., Kelbauskas, L., Hoffmann, B., Klöcker, N., Becker, W., Bergmann, A., Benndorf, K.:
Multi-dimensional fluorescence lifetime and FRET measurements.
Microsc. Res. Tech. 70, 442-451 (2007).
Shen Q.H., Saijo Y., Mauch S., Biskup C., Bieri S., Keller B., Seki H., Ülker B., Somssich I., Schulze-Lefert P.:
Nuclear activity of MLA immune receptors links isolate-specific and basal resistance responses.
Science 315, 1098-1103 (2007).
Orthaus S., Biskup C., Hoffmann B., Hoischen C., Ohndorf S., Benndorf K., Diekmann S.:
Assembly of the inner kinetochore proteins CENP-A and CENP-B in living human cells.
ChemBioChem 9, 77-92 (2007).
Hoffmann B., Zimmer T., Klöcker N., Kelbauskas L., König K., Benndorf K., Biskup C.:
Prolonged irradiation of ECFP and Cerulean can invalidate FRET measurements.
J. Biomed. Opt. 13, 031205 (2008).
Kwaaitaal M., Keinath N.F., Pajonk S., Biskup C., Panstruga R.:
Combined bimolecular fluorescence complementation and Forster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.
Plant Physiol. 152,1135-1147 (2010).
Hoffmann B., Klöcker N., Benndorf K., Biskup C.:
Visualization of the dynamics of PSD-95 and Kir2.1 interaction by fluorescence lifetime-based resonance energy transfer imaging.
Medical Photonics 27, 70-82 (2015).