SFB Transregio ReceptorLight

Hochleistungs-Lichtmikroskopie zur Aufklärung der Funktion von Membranrezeptoren

Im Rahmen des CRC/TR ReceptorLight werden lichtmikroskopische Techniken mit höchster räumlicher und zeitlicher Auflösung angewendet und weiter entwickelt, um neue Erkenntnisse über die Funktion von Membranrezeptoren zu gewinnen. Als Reaktion auf die Bindung sogenannter Liganden generieren Membranrezeptoren Signale, die die Zellen eines Organismus auf vielfältige Weise beeinflussen können. In den vergangenen Jahren ermöglichten neue lichtmikroskopische Methoden essentielle Einblicke in die Funktion von Membranrezeptoren, zum Beispiel in Bezug auf die Geschwindigkeitskonstanten der Bindung von Liganden an Rezeptorproteine sowie die Konformationsänderungen innerhalb der Rezeptorproteine. In Bezug auf die Lokalisation der Rezeptoren wurde eine räumliche Auflösung im Bereich von 20 nm erreicht, was weit unterhalb der von Ernst Abbe beschriebenen optischen Beugungsgrenze des Lichtes liegt.

Die Arbeitsgruppen in Jena und Würzburg bündeln ihre methodologische Expertise auf dem Gebiet der High-End-Miskroskopie mit ihrer Expertise im Bereich Physiologie und Biophysik von Membranrezeptoren. Diese Zusammarbeit zielt darauf ab, Funktion und Verteilung verschiedener Rezeptortypen zu studieren und parallel die Entwicklung neuer lichtmikroskopischer Techniken voranzutreiben. Die 21 Gruppen des Konsortiums wenden unter anderen folgende Methoden an: Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie, 3-Dimensionales Zwei-Photonen-Calcium-Imaging, Einzelmolekülstrategien, Tip-enhanced Raman-Spectroscopy, konfokale Patch-Clamp-Fluorometrie, Förster-Resonanz-Energie-Transfer-Analysen, Fluoreszenz-Korrelationsspektroskope sowie Kombinationen aus diesen. Diese Methoden und komplexe mathematische Algoritmen for die Datenanalyse werden von den Mitgliedern dieses Konsortiums in enger Kooperation angewendet.

Am Institut für Physiologie II sind die folgenden Projekte angesiedelt.

A5 Zusammenhang zwischen Bindungen einzelner Liganden und Aktivierung einzelner HCN- und CNG-Kanäle

Von CNGA2-Kanälen sollen die Bindung einzelner markierter cGMP-Moleküle und die Einzelkanal-Aktivität simultan gemessen werden. Zusätzlich soll eine Analyse für aufgeklebte Membranen entwickelt werden, um die Verweildauer einzelner markierter cAMP-Moleküle an den vier Untereinheiten eines HCN2-Kanals zu analysieren. Neue cGMP- und cAMP-Derivate sollen synthetisiert werden. Die Resultate sollen zu einem besseren Verständnis der Interaktion der vier Untereinheiten in den Kanälen führen und den Effekt der Spannung auf diese Interaktion in HCN2-Kanälen erklären.

Prof. Dr. Klaus Benndorf

Telefon: 03641 - 9 397651

B1 Untersuchung der Assemblierung, der Ligandenbindung und des Schaltens heterotetramerer CNG-Kanäle über FRET-Messungen

Durch cyclische Nukleotide gesteuerte Kanäle (CNG-Kanäle) stellen den letzten Schritt in der Signaltransduktionskaskade von Photorezeptoren dar. In diesem Projekt sollen mit Hilfe optischer und elektrophysiologischer Techniken (u.a. konfokale Patch-Clamp-Fluorometrie, Förster Resonance Energie Transfer) folgende Fragen beantwortet werden: In welcher Reihenfolge binden die Liganden an die Kanal-Untereinheiten? Ist die Öffnung des Kanals das Ergebnis einer konzertierten Konformationsänderung aller vier Untereinheiten? Welche Konformationsänderungen werden durch Ligandenbindung induziert?

Ein zweiter Teil des Projektes zielt auf die Untersuchung der Mechanismen ab, die die feste Stöchiometrie der Untereinheiten gewährleisten, aus denen sich die tetrameren Kanäle zusammensetzen. Diese Mechanismen, welche für die erfolgreiche Expression des Kanals in die Plasmamembran verantwortlich sind, sind im Falle einer Störung die Ursache vieler kanalbezogener Krankheiten.

Mit Hilfe von FRET-Messungen werden wir untersuchen, in welchem Zellkompartiment die Kanäle zusammengesetzt sind, welche Untereinheiten zuerst assoziieren und wie der Kanal in die Plasmamembran transportiert wird.

Dr. Vasilica Nache

Telefon: 03641 - 9 397668

B7 Beziehung zwischen Ligandenbindung und Aktivierung in nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren

Ziel dieses Projektes ist es, die Beziehung zwischen Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung in nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) zu untersuchen. Zu diesem Zweck werden neue ACh-Analoga synthetisiert und charakterisiert und in der konfokalen Patch-Clamp-Fluorometrie angewendet. Nikotinische Azetylcholin-Rezeptoren gehören zur Superfamilie der neurotransmitter-gesteuerten Cys-Loop-Rezeptoren. Sie werden in verschiedenen neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen exprimiert. In zentralen und peripheren Neuronen sowie an Skelettmuskelzellen vermitteln sie eine schnelle synaptische cholinerge Transmission.

Die Stromantworten dieser liganden-gesteuerten Ionenkanäle sind durch eine schnelle Aktivierung und eine darauf folgende komplexe Desensitisierung charakterisiert. Während die Aktivierung sehr gut verstanden ist, bleiben für die Desensitisierung noch viele Fragen offen. Die in diesem Projekt erhobenen Daten sollen zu einem tieferen Verständnis der Desensitierungsprozesse in nikotinischen Azetylcholinrezeptoren des adulten Muskels beitragen und im Besonderen auch die Rolle des Clustering-Proteins Rapsyn beleuchten.

Da es sich bei den desensitisierten Zuständen um hoch-affine, elektrisch stumme Zustände handelt, liegt der technische Focus auf der konfokalen Patch-Clamp-Fluorometrie (cPCF), eine Technik, die elektrophysiologische Patch-Clamp-Techniken mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie kombiniert. Unter Verwendung eines Fluoreszenz-markierten Agonisten kann somit der Aktivierungszustand parallel mit der Ligandenbindung gemessen und beide Parameter direkt miteinander in Beziehung gesetzt werden. Wir erwarten uns somit ein kompletteres Bild über die Vorgänge während des Desensitisierungsprozesses.

Dr. Jana Kusch

Telefon: 03641 - 9 397668

C4 Kinetik metabotroper Glutamat-Rezeptoren

Die Aktivierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) scheint um mehr als fünf Größenordnungen zu variieren, wobei methodische Gründe die Analysen begrenzen. Es sollen Verfahren entwickelt werden, die Aktivierungskinetik metabotroper GPCRs genau zu messen. Dazu werde Konzentrationssprünge von Agonisten, mechanisch oder durch geblitzte Photolyse induziert, sowie photosensible gebundene Agonisten verwendet. Die Rezeptor-Antwort wird über Förster-Resonanz-Energie-Transfer an Rezeptor-Konstrukten mit geeigneten Fluorophoren erfasst. Die Daten werden mit Markov-Modellen analysiert.

Prof. Dr. Klaus Benndorf

Telefon: 03641 - 9 397651